Производи
Комплет за откривање на Lifecosm SARS-Cov-2-RT-PCR за 2019-nCoV
Очекувана употреба
Овој комплет се користи за квалитативно откривање на нов коронавирус (2019-nCoV) со помош на брисеви од грло, назофарингеални брисеви, течност за бронхоалвеоларна лаважа, спутум. Резултатот од откривањето на овој производ е само за клиничка референца и не треба да се користи како единствен докази за клиничка дијагноза и третман.Се препорачува сеопфатна анализа на состојбата во комбинација со клиничките манифестации на пациентот и други лабораториски тестови.
Принцип на инспекција
Комплетот се заснова на едностепена RT-PCR технологија.Всушност, гените ORF1ab и N на новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV) беа избрани како целни региони за засилување.Специфични прајмери и флуоресцентни сонди (Н генските сонди се означени со FAM, а ORF1ab сонди се означени со HEX) се дизајнирани да детектираат РНК од новиот тип на коронавирус од 2019 година во примероците.Комплетот вклучува и ендоген систем за откривање на внатрешна контрола (интерна контролна генска сонда означена со CY5) за следење на процесот на собирање примероци, засилување на РНК и PCR, со што се намалуваат лажно негативните резултати.
Главни компоненти
| Компоненти | Волумен(48Т/комплет） |
| Раствор за реакција на RT-PCR | 96 µl |
| nCOV прајмер TaqMan сонда-мешавина (ORF1ab, N ген, RnaseP ген) | 864 µl |
| Негативна контрола | 1500 µl |
| nCOV Позитивна контрола (l ORF1ab N ген) | 1500 µl |
Сопствени реагенси: реагенси за екстракција или прочистување на РНК.Негативна/позитивна контрола: Позитивната контрола е РНК која го содржи целниот фрагмент, додека негативната контрола е вода без нуклеинска киселина.За време на употребата, тие треба да учествуваат во екстракцијата и треба да се сметаат за заразни.Тие треба да се ракуваат и да се отстранат во согласност со релевантните прописи.
Внатрешниот референтен ген е човечкиот ген RnaseP.
Услови на чување и рок на употреба
-20±5℃, избегнувајте повторено замрзнување и одмрзнување повеќе од 5 пати, важност за 6 месеци.
Применлив инструмент
Со FAM / HEX / CY5 и друг повеќеканален флуоресцентен PCR инструмент.
Барања за примероци
1. Применливи типови примероци: брисеви од грло, назофарингеални брисеви, течност за бронхоалвеоларна лаважа, спутум.
2. Собирање примероци (асептична техника)
Фарингеален брис: Избришете ги крајниците и задниот фарингеален ѕид со два брис во исто време, а потоа потопете ја главата на брис во епрувета што го содржи растворот за земање примероци
Спутум: Откако пациентот ќе има длабока кашлица, соберете го искашланиот спутум во епрувета со заврткана капа што го содржи растворот за земање мостри;Течност за бронхоалвеоларна лаважа: Земање примероци од медицински професионалци.3.Складирање и транспорт на примероци
Примероците за изолација на вирусот и РНК тестирање треба да се тестираат што е можно поскоро.Примероците што можат да се откријат во рок од 24 часа може да се чуваат на 4℃;оние кои не можат да се откријат во рок од 24
часовите треба да се чуваат на -70℃ или пониско (ако нема услови за складирање од -70℃, тие треба да бидат
привремено се чува на -20℃ фрижидер).Примероците треба да избегнуваат повеќекратно замрзнување и одмрзнување за време на транспортот.Примероците треба да се испратат во лабораторија што е можно поскоро по собирањето.Ако примероците треба да се транспортираат на долги растојанија, се препорачува складирање на сув мраз.
Тест методи
1 Обработка на примерок и екстракција на РНК (област за обработка на примероци)
Се препорачува да се земат 200 μl течен примерок за екстракција на РНК.За поврзаните чекори за екстракција, погледнете ги упатствата на комерцијалните комплети за екстракција на РНК.И негативните и негативните
контролите во овој комплет беа вклучени во екстракцијата.
2 Подготовка на PCR реагенс (област за подготовка на реагенс)
2.1 Отстранете ги сите компоненти од комплетот и одмрзнете ги и измешајте на собна температура.Центрифугирајте со 8.000 вртежи во минута неколку секунди пред употреба;пресметајте ја потребната количина на реагенси и системот за реакција се подготвува како што е прикажано во следната табела:
| Компоненти | Порција N (25µl систем) |
| nCOV прајмер TaqMan сонда смеса | 18 µl × N |
| Раствор за реакција на RT-PCR | 2 µl × N |
| *N = број на тестирани примероци + 1 (негативна контрола) + 1 (nCOVпозитивна контрола) | |
2.2.
3 Земање примероци (област за подготовка на примерокот)
Додадете 5 μl од негативните и позитивните контроли по екстракцијата.РНК на примерокот што треба да се тестира се додава во цевката за реакција на PCR.
Цврсто затворете ја цевката и центрифугирајте со 8.000 вртежи во минута неколку секунди пред да ја префрлите во областа за откривање засилување.
4 PCR засилување (засилена област за откривање)
4.1 Ставете ја реакционата цевка во ќелијата за примерок на инструментот и поставете ги параметрите на следниов начин:
| фаза | Циклус број | Температура(°C) | Време | собирањесајт |
| Обратнотранскрипција | 1 | 42 | 10 мин | - |
| Пред денатурацијаn | 1 | 95 | 1мин | - |
| Циклус | 45 | 95 | 15-ти | - |
| 60 | 30-ти | собирање на податоци |
Избор на канал за откривање инструмент: Изберете го каналот FAM, HEX, CY5 за флуоресцентниот сигнал.За референтна флуоресцентна НИКОЈ, ве молиме не избирајте ROX.
5 Анализа на резултати (Ве молиме погледнете ги експерименталните упатства на секој инструмент за поставување)
По реакцијата, зачувајте ги резултатите.По анализата, прилагодете ја почетната вредност, крајната вредност и прагот на основната линија според сликата (корисникот може да се прилагоди според фактичката ситуација, почетната вредност може да се постави на 3~15, крајната вредност може да се постави на 5~20, прилагодување) во логаритамскиот график На прагот на прозорецот, прагот е во логаритамска фаза, а кривата на засилување на негативната контрола е права линија или под прагот).
6 Контрола на квалитет (процедурална контрола е вклучена во тестот) Негативна контрола: Нема очигледна крива на засилување за каналите за откривање FAM, HEX, CY5
Позитивна контрола на COV: очигледна крива на засилување на каналите за откривање FAM и HEX, Ct вредност≤32, но без крива на засилување на каналот CY5;
Горенаведените барања мора да се исполнат истовремено во истиот експеримент;во спротивно, експериментот е неважечки и треба да се повтори.
7 Определување резултати.
7.1 Ако нема крива на засилување или Ct вредност> 40 во каналите FAM и HEX на примерокот за тестирање, а има крива на засилување во каналот CY5, може да се процени дека нема нов коронавирус од 2019 година (2019-nCoV) РНК во примерокот;
.2 Ако примерокот за тестирање има очигледни криви на засилување во каналите FAM и HEX, а вредноста на Ct е ≤40, може да се оцени дека примерокот е позитивен за новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV).
7.3 Ако примерокот за тестирање има јасна крива на засилување само во еден канал на FAM или HEX, а вредноста на Ct е ≤40, а во другиот канал нема крива на засилување, резултатите треба повторно да се тестираат.Ако резултатите од повторното тестирање се конзистентни, примерокот може да се оцени како позитивен за новиот
коронавирус 2019 (2019-nCoV).Ако резултатот од повторното тестирање е негативен, може да се процени дека примерокот е негативен за новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV).
Позитивна проценка вредност
Методот на крива ROC се користи за одредување на референтната CT вредност на комплетот, а референтната вредност на внатрешната контрола е 40.
Толкување на резултатите од тестот
1. Секој експеримент треба да се тестира за негативни и позитивни контроли.Резултатите од тестот може да се утврдат само кога контролите ги исполнуваат барањата за контрола на квалитетот
2.Кога каналите за откривање FAM и HEX се позитивни, резултатот од каналот CY5 (канал за внатрешна контрола) може да биде негативен поради конкуренцијата на системот.
3. Кога резултатот од внатрешната контрола е негативен, ако каналите за откривање FAM и HEX на епрувета се исто така негативни, тоа значи дека системот е оневозможен или работата е погрешна, тестот е неважечки.Затоа, примероците треба повторно да се тестираат.
