Овој комплет се користи за квалитативно откривање на нов коронавирус (2019-nCoV) со употреба на брисеви од грло, назофарингеални брисеви, течност за бронхоалвеоларна лаважа, спутум. Резултатот од откривањето на овој производ е само за клиничка референца и не треба да се користи како единствен доказ за клиничка дијагноза и третман. Се препорачува сеопфатна анализа на состојбата во комбинација со клиничките манифестации на пациентот и други лабораториски тестови.
Комплетот е базиран на едночекорна RT-PCR технологија. Всушност, гените ORF1ab и N за новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV) беа избрани како целни региони за амплификација. Специфични прајмери и флуоресцентни сонди (N генските сонди се обележани со FAM, а ORF1ab сонди се обележани со HEX) се дизајнирани да детектираат РНК од новиот тип на коронавирус од 2019 година во примероци. Комплетот, исто така, вклучува ендоген систем за детекција на внатрешна контрола (сонда за внатрешен контролен ген обележана со CY5) за следење на процесот на собирање примероци, РНК и PCR амплификација, со што се намалуваат лажно негативните резултати.
Компоненти | Јачина на звук(48T/Комплет) |
RT-PCR раствор за реакција | 96µl |
nCOV прајмер TaqMan сонда-мешавина (ORF1ab, N ген, RnaseP ген) | 864µl |
Негативна контрола | 1500µl |
nCOV Позитивна контрола (l ORF1ab N ген) | 1500µl |
Сопствени реагенси: реагенси за екстракција на РНК или прочистување. Негативна/позитивна контрола: Позитивната контрола е РНК што го содржи целниот фрагмент, додека негативната контрола е вода без нуклеинска киселина. За време на употребата, тие треба да учествуваат во екстракцијата и треба да се сметаат за заразни. Со нив треба да се ракува и да се отстранува во согласност со релевантните прописи.
Внатрешниот референтен ген е човечкиот RnaseP ген.
-20 ± 5℃, избегнувајте повторено замрзнување и одмрзнување повеќе од 5 пати, важи 6 месеци.
Со FAM / HEX / CY5 и друг повеќеканален флуоресцентен PCR инструмент.
1. Применливи типови примероци: брисеви од грло, назофарингеални брисеви, бронхоалвеоларна лаважна течност, спутум.
2. Собирање примероци (асептична техника)
Фарингеален брис: Избришете ги крајниците и задниот фарингеален ѕид со два брисева истовремено, а потоа потопете ја главата на брисот во епрувета што го содржи растворот за земање примероци.
Спутум: Откако пациентот ќе се закашла длабоко, соберете го искашланиот спутум во епрувета со капаче на завртка што го содржи растворот за земање примероци; течност за бронхоалвеоларна лаважа: Земање примероци од страна на медицински професионалци. 3. Складирање и транспорт на примероци
Примероците за изолација на вирусот и тестирање на РНК треба да се тестираат што е можно поскоро. Примероците што можат да се детектираат во рок од 24 часа може да се чуваат на 4℃; оние што не можат да се детектираат во рок од 24
часовите треба да се чуваат на -70℃ или пониско (доколку нема услови за складирање од -70℃, тие треба да се
привремено складирано на -20℃ фрижидер). Примероците треба да се избегнуваат повторено замрзнување и одмрзнување за време на транспортот. Примероците треба да се испратат во лабораторија што е можно поскоро по собирањето. Доколку примероците треба да се транспортираат на долги растојанија, се препорачува складирање во сув мраз.
1 Обработка на примероци и екстракција на РНК (област за обработка на примероци)
Се препорачува да се земат 200 μl течен примерок за екстракција на РНК. За поврзаните чекори за екстракција, погледнете ги упатствата на комерцијалните комплети за екстракција на РНК. И негативниот и негативниот
контролите во овој комплет беа вклучени во екстракцијата.
2 Подготовка на PCR реагенс (област за подготовка на реагенс)
2.1 Извадете ги сите компоненти од комплетот и одмрзнете ги и измешајте ги на собна температура. Центрифугирајте на 8.000 вртежи во минута неколку секунди пред употреба; пресметајте ја потребната количина на реагенси, а реакцискиот систем се подготвува како што е прикажано во следната табела:
Компоненти | N порција (систем од 25µl) |
nCOV прајмер TaqMan сонда смеса | 18 µl × N |
RT-PCR раствор за реакција | 2 µl × N |
*N = број на тестирани примероци + 1 (негативна контрола) + 1 (nCOVпозитивна контрола) |
2.2 Откако темелно ќе ги измешате компонентите, центрифугирајте кратко време за да се остави целата течност на ѕидот на цевката да падне на дното на цевката, а потоа аликвотирајте го системот за амплификација од 20 µl во PCR цевката.
3 Земање примероци (област за подготовка на примероци)
Додадете 5 μl од негативните и позитивните контроли по екстракцијата. РНК-то од примерокот што треба да се тестира се додава во PCR реакционата епрувета.
Цврсто затворете ја епруветата и центрифугирајте на 8.000 вртежи во минута неколку секунди пред да ја префрлите во зоната за детекција на засилување.
4 PCR амплификација (засилена област за детекција)
4.1 Ставете ја реакционата епрувета во ќелијата за примероци на инструментот и поставете ги параметрите на следниов начин:
фаза | Циклус број | Температура(°C) | Време | колекцијалокација |
Обратнотранскрипција | 1 | 42 | 10 мин | - |
Пред-денатурацијаn | 1 | 95 | 1 мин | - |
Циклус | 45 | 95 | 15 секунди | - |
60 | 30-ти | собирање податоци |
Избор на канал за детекција на инструментот: Изберете го каналот FAM, HEX, CY5 за флуоресцентниот сигнал. За референтен флуоресцентен NONE, ве молиме не изберете ROX.
5 Анализа на резултатите (Ве молиме погледнете ги експерименталните упатства на секој инструмент за поставување)
По реакцијата, зачувајте ги резултатите. По анализата, прилагодете ја почетната вредност, крајната вредност и граничната вредност на основната линија според сликата (корисникот може да ја прилагоди според реалната ситуација, почетната вредност може да се постави на 3~15, крајната вредност може да се постави на 5~20, прилагодување) во логаритамскиот графикон. На прагот на прозорецот, граничната линија е во логаритамска фаза, а кривата на засилување на негативната контрола е права линија или под граничната линија).
6 Контрола на квалитетот (во тестот е вклучена процедурална контрола) Негативна контрола: Нема очигледна крива на засилување за каналите за детекција FAM, HEX, CY5
COV позитивна контрола: очигледна крива на амплификација на FAM и HEX каналите за детекција, Ct вредност ≤32, но нема крива на амплификација на CY5 каналот;
Горенаведените барања мора да бидат исполнети истовремено во истиот експеримент; во спротивно, експериментот е неважечки и треба да се повтори.
7 Одредување на резултатите.
7.1 Доколку нема крива на амплификација или Ct вредност > 40 во FAM и HEX каналите на примерокот за тестирање, а има крива на амплификација во CY5 каналот, може да се процени дека нема РНК од новиот коронавирус 2019 (2019-nCoV) во примерокот;
.2 Доколку примерокот за тестирање има очигледни криви на засилување во FAM и HEX каналите, а вредноста Ct е ≤40, може да се процени дека примерокот е позитивен за новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV).
7.3 Доколку примерокот за тестирање има јасна крива на засилување само во еден канал на FAM или HEX, а вредноста Ct е ≤40, а нема крива на засилување во другиот канал, резултатите треба повторно да се тестираат. Доколку резултатите од повторното тестирање се конзистентни, примерокот може да се оцени како позитивен за новиот
коронавирус 2019 (2019-nCoV). Доколку резултатот од повторното тестирање е негативен, може да се процени дека примерокот е негативен за новиот коронавирус од 2019 година (2019-nCoV).
Методот на ROC крива се користи за да се одреди референтната CT вредност на комплетот, а референтната вредност на внатрешната контрола е 40.
1. Секој експеримент треба да се тестира за негативни и позитивни контроли. Резултатите од тестот можат да се утврдат само кога контролите ги исполнуваат барањата за контрола на квалитетот.
2. Кога каналите за детекција FAM и HEX се позитивни, резултатот од CY5 каналот (канал за внатрешна контрола) може да биде негативен поради конкуренцијата во системот.
3. Кога резултатот од внатрешната контрола е негативен, ако каналите за детекција FAM и HEX на епруветата се исто така негативни, тоа значи дека системот е оневозможен или работата е погрешна, односно тестот е неважечки. Затоа, примероците треба повторно да се тестираат.